Nanocząstki srebra wykrywają pozostałości leków w wodzie

Czy resztki leków zagrażają środowisku i zdrowiu?

Pozostałości farmaceutyków, takie jak ketoprofen (KTP) i trimetoprim (TMP), są coraz częściej identyfikowane jako niepokojące zanieczyszczenia środowiskowe. Te substancje często przetrwają konwencjonalne procesy oczyszczania ścieków i gromadzą się w rzekach, jeziorach, a nawet wodach gruntowych, stanowiąc zagrożenie nie tylko dla ekosystemów, ale również dla zdrowia ludzkiego poprzez wodę pitną i łańcuchy pokarmowe.

KTP, niesteroidowy lek przeciwzapalny (NLPZ), wykrywany jest w ściekach i rzekach w stężeniach od 3,15 ng/L do 209 μg/L, odzwierciedlając zarówno niskie poziomy tła, jak i epizodyczne skoki w zanieczyszczonych systemach. Nawet w śladowych ilościach wykazuje toksyczność rozwojową i fizjologiczną dla organizmów słodkowodnych, takich jak glony i ryby. Z kolei TMP, bakteriostatyczny antybiotyk często przepisywany w połączeniu z sulfametoksazolem, jest regularnie wykrywany w ściekach oczyszczalni w stężeniach 0,41-1,0 μg/L oraz w rzekach w stężeniach od dziesiątek do setek ng/L, czasami osiągając 0,02-0,04 μg/L w wodach Wielkiej Brytanii i Japonii. “W stężeniach występujących w środowisku TMP hamuje wzrost glonów i zmienia funkcje społeczności mikrobiologicznych, podczas gdy nawet 10-100 μg/L wystarczy, by wywierać presję selekcyjną sprzyjającą opornym szczepom Escherichia coli” – piszą autorzy badania, podkreślając wkład TMP w globalny kryzys oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe (AMR).

Czy SERS może zastąpić tradycyjne metody analityczne?

Konwencjonalne metody monitorowania pozostałości farmaceutyków, szczególnie wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) i chromatografia cieczowa ze spektrometrią mas (LC-MS), zapewniają doskonałą czułość i specyficzność. Są jednak drogie, wymagają wykwalifikowanych operatorów i czasochłonnego przygotowania próbek, a często są ograniczone do scentralizowanych laboratoriów. Te wady utrudniają nadzór na dużą skalę lub w warunkach terenowych.

Naukowcy z Wietnamu badali wykorzystanie techniki powierzchniowo wzmocnionego rozpraszania Ramana (SERS) jako alternatywnej metody wykrywania pozostałości farmaceutycznych. SERS łączy specyficzność wibracyjną spektroskopii Ramana z elektromagnetycznym wzmocnieniem z lokalizowanego powierzchniowego rezonansu plazmonowego w nanostrukturach metalicznych, zapewniając współczynniki wzmocnienia rzędu 10^6-10^8. Pozwala to na wykrywanie śladowych analitów, nawet na poziomie pojedynczej cząsteczki, w złożonych matrycach. Co istotne, wzmocnienia SERS powstają nie tylko z elektromagnetycznych “gorących punktów” (mechanizm elektromagnetyczny – EM), ale także z mechanizmu chemicznego (CM), szczególnie oddziaływań przeniesienia ładunku (CT) między analitem a podłożem metalicznym.

W swoich badaniach naukowcy skupili się na ketoprofenie i trimetoprimie jako modelowych zanieczyszczeniach farmaceutycznych, które są istotne środowiskowo i analitycznie. Interesujące jest to, że obliczone poziomy LUMO (najniższy nieobsadzony orbital molekularny) tych związków są stosunkowo podobne, co stwarza okazję do zbadania, jak wykrywalność SERS zależy nie tylko od dopasowania orbitalnego, ale także od charakterystyki adsorpcji.

Badacze porównali odpowiedzi SERS ketoprofenu i trimetoprimu na nanostrukturach srebrnych, dążąc do racjonalizacji ich wydajności poprzez zachowanie adsorpcyjne i rozważania dotyczące poziomów energetycznych. “Nasze poprzednie prace eksperymentalnie wykazały decydującą rolę LUMO w umożliwianiu wzmocnienia SERS” – wyjaśniają autorzy. “Antybiotyki z poziomami LUMO bliższymi poziomu Fermiego nanocząstek srebra były łatwo wykrywalne, podczas gdy te z bardziej odległymi poziomami LUMO dawały znikome sygnały SERS w identycznych warunkach.”

Jakie mechanizmy wpływają na efektywność detekcji SERS?

W badaniu wykorzystano nanocząstki srebra (e-AgNPs) syntezowane zmodyfikowaną metodą elektrochemiczną. Charakterystyka e-AgNPs obejmowała spektroskopię absorpcyjną UV-visible, która wykazała ostry i symetryczny pik rezonansu plazmonów powierzchniowych (SPR) przy 402 nm, wskazujący na dobrze zdyspergowane, sferyczne nanocząstki o minimalnej aglomeracji. Dyfrakcja rentgenowska potwierdziła krystaliczną strukturę e-AgNPs z preferencyjną orientacją płaszczyzny (111), podczas gdy obrazowanie SEM wykazało prawie sferyczne cząstki o średniej średnicy około 50 nm – rozmiar optymalny dla maksymalnego wzmocnienia SERS.

Aby zbadać rolę dopasowania elektronowego, badacze wykorzystali woltamperometrię cykliczną (CV) do określenia potencjałów utleniania i redukcji TMP i KTP, które następnie przekształcono w poziomy energetyczne HOMO i LUMO. Dla TMP, krzywa CV wykazała początkowy potencjał utleniania 1,17 V i początkowy potencjał redukcji -0,92 V, dając poziomy HOMO i LUMO odpowiednio -5,52 eV i -3,48 eV. Dla KTP, początki utleniania i redukcji zaobserwowano przy -0,07 V i -0,95 V, odpowiadające poziomom HOMO i LUMO -4,29 eV i -3,42 eV.

Wyniki badań wykazały, że mimo podobnych poziomów LUMO (z różnicą zaledwie 0,06 eV), trimetoprim i ketoprofen wykazują fundamentalnie różne odpowiedzi SERS. TMP daje silne i powtarzalne pasma SERS, w tym wyraźne piki przy 482 cm^-1, 593 cm^-1, 785 cm^-1 i 1325 cm^-1, związane odpowiednio z zginaniem -NH2, rozciąganiem pirymidyny w płaszczyźnie, oddychaniem pierścienia pirymidynowego i rozciąganiem benzenowym C-O/C-C. Wśród nich pasmo przy 785 cm^-1 jest dominującą cechą, pozostającą wyraźnie wykrywalną nawet przy stężeniu 10^-5 M. Natomiast KTP dawał słabsze i mniej powtarzalne sygnały SERS. Słabe cechy zaobserwowano przy 704 cm^-1 (deformacja C-H; kołysanie CH3), 1004 cm^-1 (symetryczne rozciąganie Φ-C-C-Φ, oddychanie fenylowe), 1031 i 1138 cm^-1 (deformacja pierścienia), 1194 cm^-1 (rozciąganie C-C) i 1598 cm^-1 (rozciąganie pierścienia aromatycznego).

Co ciekawe, te różnice nie wynikają z dopasowania elektronowego, ale z geometrii adsorpcji i chemii kotwiczenia. TMP preferencyjnie adsorbuje się na powierzchniach Ag poprzez atomy azotu w pierścieniu pirymidynowym, przyjmując orientację prawie prostopadłą, która sprzyja silnej chemisorpcji i wydajnemu przeniesieniu ładunku. Dominacja trybu oddychania pirymidynowego przy 785 cm^-1 w widmach SERS TMP jest zgodna z tą geometrią, ponieważ reguły wyboru powierzchni SERS przewidują zwiększoną intensywność dla drgań bezpośrednio sprzężonych z miejscami adsorpcji. Oprócz koordynacji pirymidynowej, podstawniki aminowe TMP mogą słabo oddziaływać z Ag poprzez donację par elektronowych, dodatkowo stabilizując kompleks adsorpcyjny.

Natomiast KTP polega głównie na grupie karboksylanowej do adsorpcji. Podczas gdy karboksylany mogą wiązać się z Ag, rozbudowana struktura aromatyczna KTP ogranicza cząsteczkę przed przyjęciem płaskiej orientacji, wymuszając pochyloną geometrię, która ogranicza sprzężenie elektronowe z powierzchnią Ag. W rezultacie tylko wewnętrznie silne tryby Ramana, takie jak drgania oddychania fenylowego około 1004 cm^-1, pozostają obserwowalne, ale z dużo niższą intensywnością i powtarzalnością niż TMP.

Badacze porównali również zachowanie adsorpcji TMP i KTP na e-AgNPs za pomocą spektroskopii absorpcyjnej UV-vis. Dla TMP, charakterystyczne pasmo absorpcji przy 270 nm stopniowo zmniejszało się wraz z rosnącym czasem inkubacji, wskazując na adsorpcję cząsteczek TMP na powierzchni e-AgNPs. W przeciwieństwie do tego, intensywność absorpcji KTP przy 260 nm zmniejszyła się tylko o 3% przed osiągnięciem stanu ustalonego po 30 minutach inkubacji, potwierdzając jego słabsze powinowactwo adsorpcyjne. Obliczenia pojemności adsorpcyjnej wykazały, że w stanie równowagi maksymalna liczba cząsteczek TMP zaadsorbowanych na e-AgNPs jest prawie 4-krotnie wyższa niż cząsteczek KTP.

Czy można poprawić wykrywalność KTP pomimo tych ograniczeń? Badacze odkryli, że dodatek jonów chlorkowych może aktywować powierzchnię Ag i znacząco poprawić wykrywanie KTP. Dodanie NaCl w optymalnym stężeniu (10^-4 M) prowadziło do wyraźnego wzmocnienia odpowiedzi SERS, gdzie intensywność pasma przy 1004 cm^-1 wzrosła prawie 2,5-krotnie w porównaniu z systemem bez chlorku.

W niskich do umiarkowanych stężeniach, jony chlorkowe wypierają ligandy cytrynianu, ściskają elektryczną podwójną warstwę i tworzą stany powierzchniowe AgCl_x^-, odsłaniając nowe miejsca wiązania i ułatwiając przeniesienie ładunku do LUMO KTP. Gdy chlorek jest obecny w nadmiarze, jednak, nadmierne pokrycie powierzchni przez Cl^- blokuje dostępne miejsca adsorpcji, podczas gdy silne ekranowanie elektrostatyczne zmniejsza zdolność cząsteczek KTP do zbliżenia się do powierzchni. Tak więc optymalne wzmocnienie występuje tylko w wąskim oknie stężenia chlorku, przy czym 10^-4 M zapewnia najlepszą równowagę między aktywacją a stabilnością.

Jakie korzyści płyną z zastosowania SERS w praktyce klinicznej?

Opracowane czujniki SERS na bazie e-AgNP wykazały doskonałą wydajność ilościową dla obu analitów. Dla TMP, limit wykrywalności (LOD) wynosił 3,84 × 10^-9 M, z liniowym zakresem obejmującym sześć rzędów wielkości (10^-3 M do 10^-9 M). Jednolitość podłoży e-AgNP została zweryfikowana przez rejestrację widm z pięciu losowo wybranych punktów na jednym podłożu, dając względne odchylenie standardowe (RSD) 12,8%. Powtarzalność między podłożami została dodatkowo zbadana przez przetestowanie pięciu niezależnie przygotowanych podłoży AgNP, dając RSD 14,0%.

Dla KTP, przy optymalnych warunkach aktywacji chlorkowej, LOD oszacowano na 2,69 × 10^-8 M, z liniowym zakresem od 10^-3 M do 10^-7 M. Jednorodność podłoża oceniono przy 10^-5 M, mierząc pięć losowych punktów, dając RSD 12,5%. Powtarzalność oceniono na pięciu niezależnych podłożach e-AgNP, z RSD 14,6%.

Badacze przetestowali również czujniki w rzeczywistych próbkach, w tym w wodzie kranowej i tabletkach farmaceutycznych. TMP dodano do wody kranowej w różnych stężeniach od 10^-4 do 10^-7 M. Analiza odzysku ilościowego dała wartości między 89% a 96%, potwierdzając niezawodność i dokładność czujników SERS na bazie e-AgNP do wykrywania pozostałości TMP w rzeczywistej matrycy wody kranowej. Podobnie, KTP dodano do wody kranowej w stężeniach od 10^-4 M do 10^-7 M, uzyskując wskaźniki odzysku od 88% do 95%.

Dodatkowo zbadano zawartość TMP w komercyjnej tabletce (trimeseptol), która według etykiety zawiera dwa antybiotyki: sulfametoksazol (400 mg) i TMP (80 mg). Widmo SERS trimeseptolu na e-AgNPs wykazało wiele charakterystycznych pasm sulfametoksazolu, a także pasmo oddychania pierścienia pirymidynowego TMP. W oparciu o to pasmo, stężenie TMP w przygotowanym roztworze oszacowano na 8,6 × 10^-5 M, z odzyskiem 86% w porównaniu do ilości podanej na etykiecie. Podobnie, zawartość KTP oznaczono w komercyjnej tabletce, uzyskując odzysk 90% w porównaniu do ilości podanej na etykiecie.

Jakie to ma znaczenie dla lekarzy? Te wyniki podkreślają, że geometria adsorpcji i oddziaływania powierzchniowe, obok dopasowania elektronowego, rządzą wydajnością SERS, a parametry te mogą być projektowane w celu rozszerzenia zakresu analitów dostępnych dla SERS. Czy te nowe metody detekcji mogą pomóc w monitorowaniu zanieczyszczeń farmaceutycznych w środowisku i zapewnić lepszą kontrolę jakości leków? Badania sugerują, że tak, oferując narzędzia zarówno do monitorowania środowiskowego, jak i do kontroli jakości farmaceutycznej.

Szersze znaczenie tych badań polega na tym, że zrozumienie mechanizmów rządzących wykrywalnością SERS może prowadzić do opracowania bardziej czułych i selektywnych czujników dla szerokiego zakresu analitów farmaceutycznych. Dla lekarzy, dostępność szybkich i niezawodnych metod wykrywania leków w próbkach środowiskowych i farmaceutycznych może pomóc w monitorowaniu zgodności pacjentów, wykrywaniu podróbek leków i ocenie ryzyka środowiskowego związanego z pozostałościami farmaceutycznymi.

Czy w przyszłości będziemy rutynowo korzystać z takich czujników do szybkiego wykrywania zanieczyszczeń farmaceutycznych w próbkach środowiskowych lub do weryfikacji autentyczności leków? To pytanie pozostaje otwarte, ale obecne badania wskazują na obiecujący potencjał techniki SERS w tych zastosowaniach, szczególnie gdy jest ona dostosowana do konkretnych właściwości molekularnych analitu.

Podsumowanie

Pozostałości farmaceutyków, takie jak ketoprofen i trimetoprim, stanowią rosnące zagrożenie środowiskowe, przenikając przez konwencjonalne systemy oczyszczania ścieków i gromadząc się w wodach powierzchniowych i gruntowych. Ketoprofen, niesteroidowy lek przeciwzapalny, wykrywany jest w stężeniach od nanogramów do mikrogramów na litr, wykazując toksyczność dla organizmów wodnych. Trimetoprim, bakteriostatyczny antybiotyk, oprócz bezpośredniej toksyczności dla glonów i mikroorganizmów, przyczynia się do rozwoju oporności bakteryjnej, stanowiąc element globalnego kryzysu oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe. Tradycyjne metody monitorowania tych zanieczyszczeń, oparte na chromatografii cieczowej i spektrometrii mas, są kosztowne, czasochłonne i wymagają specjalistycznego sprzętu laboratoryjnego, co ogranicza ich zastosowanie w rutynowym nadzorze środowiskowym.

Naukowcy z Wietnamu zbadali alternatywną metodę detekcji wykorzystującą powierzchniowo wzmocnione rozpraszanie Ramana na nanostrukturach srebrnych. Technika ta łączy specyficzność spektroskopii Ramana z elektromagnetycznym wzmocnieniem z rezonansu plazmonowego, osiągając współczynniki wzmocnienia rzędu milionów, co umożliwia wykrywanie śladowych ilości analitów. Kluczowym odkryciem badania było wykazanie, że efektywność detekcji zależy nie tylko od dopasowania poziomów energetycznych orbitali molekularnych do poziomu Fermiego metalu, ale przede wszystkim od geometrii adsorpcji i charakteru wiązania cząsteczki z powierzchnią metaliczną. Trimetoprim, adsorbujący się przez atomy azotu w orientacji prostopadłej, wykazał silne i powtarzalne sygnały z limitem wykrywalności na poziomie nanomolarnym, podczas gdy ketoprofen, wiążący się poprzez grupę karboksylową w orientacji pochylonej, dawał znacznie słabsze odpowiedzi.

Badacze opracowali strategię poprawy wykrywania ketoprofenu poprzez dodatek jonów chlorkowych, które aktywują powierzchnię srebra i ułatwiają przeniesienie ładunku, zwiększając intensywność sygnału dwuipółkrotnie przy optymalnym stężeniu chlorku. Opracowane czujniki wykazały doskonałą wydajność w rzeczywistych próbkach, osiągając wskaźniki odzysku od osiemdziesięciu ośmiu do dziewięćdziesięciu sześciu procent w wodzie kranowej i tabletkach farmaceutycznych. Metoda charakteryzuje się szerokim zakresem liniowości obejmującym sześć rzędów wielkości oraz dobrą powtarzalnością z względnym odchyleniem standardowym poniżej piętnastu procent. Wyniki te wskazują na potencjał techniki SERS jako szybkiej, czułej i przenośnej alternatywy dla konwencjonalnych metod analitycznych w monitorowaniu zanieczyszczeń farmaceutycznych w środowisku oraz kontroli jakości leków, co może mieć istotne znaczenie dla oceny ryzyka zdrowotnego i wykrywania preparatów sfałszowanych.